Targeting aromatic amino acid hydroxylases (AAAHs) to modulate disrupted homeostasis of catecholamines, serotonin and melatonin

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Enzyme stabilization by small molecules targeting the catalytic binding pockets

Publication . Costa, Rita de Sousa Saraiva da; Leandro, Ana Paula Costa dos Santos Peralta; Tomé, Catarina da Silveira

De acordo com a Comissão Europeia, Doenças Órfãs, ou Doenças Raras, são doenças que afetam menos do que 1 em cada 2000 indivíduos, ou seja, são patologias que apresentam uma baixa prevalência na população. A maioria das Doenças Órfãs são doenças genéticas e devido ao seu caracter “raro” o conhecimento sobre as mesmas é escasso, assim como a disponibilidade de medicamentos para o seu tratamento. As Doenças Hereditárias do Metabolismo (DHM) constituem um grupo especial de Doenças Órfãs genéticas, causadas por mutações em genes que codificam para enzimas ou transportadores envolvidos no metabolismo intermediário. Estas condições impossibilitam o bom funcionamento da via metabólica subjacente à enzima afetada, alterando toda a homeostasia celular. A maioria das DHM tem uma apresentação clínica severa, frequentemente com consequências motoras e neurológicas graves. Para a maioria destas doenças as terapias disponíveis envolvem a manipulação da dieta (terapia dietética) ou utilização de fármacos como terapia de suporte com o objetivo de aliviar os sintomas laterais da doença, no entanto, estas abordagens não têm demonstrado resultados significativos. A maioria das alterações nucleotídicas causadoras de DHM são mutações do tipo missense (≈85%) que dão origem a proteínas completas (full-length) com substituição de apenas um aminoácido o que frequentemente condiciona a aquisição da conformação correta (misfolding) da proteína expressa. O misfolding proteico pode afetar apenas a catálise e regulação enzimática, no entanto pode também afetar os seus níveis intracelulares, uma vez que estas proteínas misfolded são reconhecidas pelos sistemas de controlo de qualidade proteica intracelular e são encaminhadas para degradação. Devido a este mecanismo as DHM são muitas vezes denominadas como doenças conformacionais por perda-de-função (loss-of function). De forma a tentar corrigir estes erros no folding proteico, tem sido desenvolvida uma nova ferramenta molecular que assenta na utilização de pequenas moléculas que interagem com as proteínas misfolded promovendo a sua estabilização estrutural e, consequentemente, melhor funcionamento, sem nunca fazer parte da sua estrutura proteica final. Estas moléculas são designadas de chaperones farmacológicos. Recentemente, surgiu uma nova classe de moléculas designada por chaperones de atividade, cujo método de ação se centra na estabilização a proteína através da promoção da sua atividade. Neste trabalho foram estudadas três enzimas, envolvidas nas DHMs, e classificadas como Doenças conformacionais por perda-de-função. A primeira enzima abordada será a galactose-1-fosfato-uridil transferase humana (hGALT). A hGALT é uma proteína homodimérica que contem um átomo de Zn2+, e que se encontra envolvida no metabolismo da galactose (via de Leloir) onde a -D-galactose é convertida em glucose-1-fosfato. Nesta via, a hGALT converte uma molécula de difosfato de uridina glucose (UDP-glucose) e galactose-1-fosfato em difosfato de uridina galactose (UDP-galactose) e glucose-1-fosfato, através da remoção de uma molécula de monofosfato de uridina (UMP) da UDP-glucose. No caso de ocorrerem alterações na via de Leloir devido a uma deficiente atividade da hGALT por mutações no gene que a codifica, a DHM é classificada como Galactosémia Clássica, ou Galactosémia do tipo I. Os doentes com Galactosémia Clássica desenvolvem os primeiros sintomas na primeira semana de vida normalmente após ingestão de leite (alimento rico em galactose). Assim, a terapia usada, até à data, para o tratamento desta doença baseia-se sobretudo na remoção de todos os alimentos que contenham este açúcar, o que representa um enorme desafio para os doentes. Apesar desta terapia dietética contribuir para a prevenção de alguns sintomas mais graves, continua a não ser suficiente para evitar complicações a longo prazo com consequências graves a nível cognitivo e motor. A segunda e terceira enzimas abordadas neste trabalho são a isoforma 1 da tirosina hidroxilase humana (hTH1) e a isoforma 2 da triptofano hidroxilase humana (hTPH2). Estas duas enzimas em conjunto com a fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) constituem a família das hidroxilases dos aminoácidos aromáticos (AAAH). Estas enzimas são homotetraméricas, utilizam como cofator a tetrahidrobiopterina (BH4) e apresentam um átomo de Fe2+ no seu centro ativo, o qual se encontra envolvido na catálise. As AAAH estão envolvidas na síntese e metabolismo de catecolaminas e serotonina, através da hidroxilação dos aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano. As catecolaminas e a serotonina inserem-se no grupo das monoaminas, cuja função assenta na neurotransmissão e neuromodulação, sendo, portanto, agentes principais na regulação de processos como a diferenciação neuronal, termorregulação, sono, homeostasia e comportamento. A hTH1 é a enzima responsável pela conversão de L-tirosina em levodopa a qual é posteriormente descarboxilada e convertida em dopamina. Em caso de uma deficiente atividade da hTH1 por mutações no gene que a codifica estamos perante uma doença neurometabólica rara denominada Síndrome de Segawa ou Deficiência de Tirosina Hidroxilase. Os doentes com esta DHM podem desenvolver dois tipos de fenótipos (A ou B) com sintomas neurológicos e motores graves que se manifestam entre os primeiros 3 – 12 meses de vida. Nesta síndrome, as terapias adotadas têm-se baseado na administração de precursores dos neurotransmissores deficitários (como a levodopa), para a atenuação de sintomas. No entanto, esta terapia também se tem demonstrado insuficiente. Por último, a hTPH2 é a enzima responsável pela conversão de L-triptofano em 5-hidroxitriptofano que, posteriormente é descarboxilado e convertido em serotonina. Patologias como o transtorno obsessivo-compulsivo, depressão, défice de atenção e hiperatividade, atos suicidas ou outro tipo de transtorno psiquiátrico, estão associados a níveis baixos de serotonina ou de outros metabolitos derivados da serotonina. Desta forma, níveis diminuídos de hTPH2 estão associados a este tipo de patologia. Apesar de já se conhecerem mutações patogénicas no gene que codifica para esta enzima, ainda existem poucas informações estruturais e funcionais sobre a hTPH2. No entanto, como esta enzima se insere na família das AAAH, conjuntamente com a hPAH e a hTH1, e uma vez que as estruturas e mecanismos de ação destas enzimas já são conhecidos e apresentam um elevado grau de similaridade, prevê-se que a hTPH2 terá um comportamento semelhante. Uma vez que as deficiências de hGALT, hTH1 e hTPH2 são classificadas como Doenças conformacionais e que para estas DHM não se encontram disponíveis terapias farmacológicas, neste trabalho estudaram-se três moléculas (composto 2, composto 14, e composto 17) de baixa massa molecular, derivados de 3-hidroxiquinolin-2-onas (3HQ), pelo seu potencial efeito sobre a hGALT, hTH1 e hTPH2 como chaperones farmacológicos ou chaperones de atividade. Estes compostos foram selecionados uma vez que o seu núcleo estrutural (3-hidroxi-quinolinina) tem a capacidade de complexar iões metálicos (ex: Fe2+ e Zn2+), os quais se encontram na estrutura das proteínas em estudo - hGALT (Zn2+), hTH1 (Fe2+) e hTPH2 (Fe2+). Os compostos testados foram produzidos pelo grupo de Química BioOrgânica do Instituto de Investigação do Medicamento da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa (iMed-ULisboa) e foram desenhados inicialmente com o intuito de interagirem com o centro ativo da hPAH. Tendo em conta a semelhança estrutural e funcional da família das AAAHs e o facto da hGALT apresentar Zn2+ na sua estrutura, testámos o efeito destes compostos na modulação da estabilidade e atividade da hGALT, hTH1 e hTPH2. Para este efeito foi necessário primeiro proceder à otimização do método de expressão e purificação da hGALT, hTH1 e hTPH2 de modo a obter proteínas recombinantes com um elevado grau de pureza e em níveis elevados. As proteínas recombinantes foram produzidas em células de E.coli BL21(DE3) e purificadas por cromatografia de afinidade com iões imobilizados. De seguida, verificámos o perfil oligomérico das proteínas purificadas através de uma cromatografia de exclusão molecular. Após a verificação do perfil da proteína purificada, procedemos aos ensaios de estabilidade e de atividade. O perfil de estabilidade térmica foi obtido por fluorimetria diferencial de varrimento, extraindo os valores de temperatura de melting das proteínas na ausência e presença dos compostos. Utilizando métodos de HPLC (High Performance Liquid Chromatography), otimizados neste trabalho para quantificação de produto formado por unidade de tempo e quantidade de proteína, foi possível determinar a atividade enzimática da hGALT, hTH1 e hTPH2 na ausência e presença dos compostos. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que, em relação à estabilização estrutural das proteínas, na generalidade estes compostos não causaram uma diferença significativa na estabilização ou destabilização das mesmas, uma vez que não se verificou uma variação igual ou superior a 2 ºC na temperatura de melting. Apenas o composto 2 teve um efeito significativo na temperatura de melting da hGALT, provocando uma diminuição de 3.4 ºC na mesma, o que indica uma destabilização da estrutura da proteína. Desta forma, não foi possível determinar para estes compostos um possível efeito terapêutico como chaperones farmacológicos para a hGALT, hTH1 e hTPH2. Em relação à atividade enzimática, verificou-se que todos os compostos incrementam a atividade enzimática da hTH1 e hTPH2, embora com respostas diferentes para cada uma das enzimas testadas. Para a hTH1 a resposta obtida foi de composto 17 > composto 2 > composto 14 (+102 > +61 > +12%, respetivamente), enquanto para a hTPH2 foi de composto 17 > composto 14 > composto 2 (+33 > +21 > +5%, respetivamente). No caso da hGALT não foi possível observar um aumento de atividade residual com os compostos 17 (+2%) e 14 (+1%), sendo que o composto 2 conduziu a uma perda de atividade de cerca de 20%. A ausência de efeito sobre a hGALT poderá indicar que estes compostos poderão apresentar um efeito específico sobre enzimas contendo Fe não-hemíco na sua estrutura. Poderá também indicar que para os compostos exercerem o seu efeito o ião metálico alvo terá que se encontrar no centro ativo, ou mais próximo deste. Perante estes resultados, considerou-se que as 3HQ estudadas apresentam um potencial efeito de chaperone de atividade em relação à hTH1 e hTPH2. Apesar dos ensaios realizados não terem sido suficientes para afirmar se os compostos testados funcionam efetivamente como chaperones de atividade ou farmacológicos, forneceram dados preliminares que permitiram avaliar o seu potencial efeito nas proteínas estudadas. Serão necessários estudos adicionais detalhados que permitam proceder a uma caracterização bioquímica e biofísica das proteínas na ausência e presença destas moléculas. Uma vez que o grupo de Metabolismo e Genética já validou a metodologia para o estudo do efeito destes derivados sobre a hPAH, é possível agora aplicar esses ensaios às enzimas estudadas neste trabalho uma vez que as metodologias para produção, purificação e determinação da atividade enzimática foram desenvolvidas na tese apresentada.

2021-01-29Master thesis

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