Targeting pathogenesis and engineering cell factories: by developing mixed regulatory-metabolic genomic models in yeasts

Financiador

Organização

Publicações

Role of the Candida glabrata Mediator complex subunit Pgd1 in azole drug resistance and susceptibility: a transcriptomics approach

Publication . Costa, Inês Margarida Vieira Marques da; Teixeira, Miguel Nobre Parreira Cacho; Dionísio, Francisco,1971-

Espécies do género Candida fazem parte da microbiota do trato gastrointestinal humano, sendo capazes de colonizar também a pele e superfícies mucosas do corpo humano, como organismos comensais. No entanto são a causa mais comum de infeções por fungos oportunistas no mundo, causando candidíases superficiais e sistémicas. As candidíases sistémicas têm uma taxa de mortalidade altíssima, especialmente quando associadas a pacientes imunocomprometidos. A espécie do género Candida mais frequentemente isolada em pacientes com candidíase é Candida albicans, mas ao longo dos anos tem se observado um aumento na frequência de infeções causadas por outras espécies do género Candida. Entre elas, Candida glabrata tornou-se na segunda causa mais comum de candidíase em humanos, maioritariamente devido à sua capacidade de adquirir resistência aos antifúngicos. Em contraste com outras espécies do género Candida, C. glabrata é haploide, não produz hifas, e apesar de ter no seu genoma os genes necessários para a reprodução sexuada e meiose, reproduz-se exclusivamente de forma clonal. No entanto tem um elevado grau de diversidade clonal, devido a alterações cromossomais, aneuploidias, translocações e mesmo à ocorrência de perda de cromossomas. Curiosamente C. glabrata é filognéticamente mais próxima de S. cerevisiae do que de C. albicans ou de outras espécies do género Candida, o que permite fazer mais facilmente inferências sobre C. glabrata, com base em estudos feitos em S. cerevisiae. Os azóis são uma classe de antifúngicos que atuam na via de biossíntese do ergosterol, efetivamente impedindo a ação da enzima lanosterol 14 α-demetilase, codificada pelo gene ERG11, bloqueando a síntese de ergosterol dentro da célula. O ergosterol é um componente importante na membrana plasmática dos fungos, e ao impedir a sua síntese, os azóis levam à síntese de um esterol tóxico para o fungo, comprometendo a integridade da membrana e vários processos fisiológicos. Experiências anteriores de microevolução, foram feitas para desvendar os mecanismos através dos quais C. glabrata adquire resistência aos azóis. Através de sequenciação genómica, descobriu-se que uma estirpe evoluida para adquirir resistência a azóis, adquiriu uma mutação no gene PGD1 (CAGL0A01325g). Surpreendentemente, verificou-se que a deleção deste gene confere resistência a azóis em meio líquido, mas susceptibilidade a azóis em meio sólido. O foco principal deste estudo foi a investigação do papel do Pgd1 na modulação da resistência e suscetibilidade a azóis. O Pgd1 é uma subunidade da cauda do complexo Mediador da RNA polimerase II, complexo este que é essencial para a formação do “pre-initiation complex”, e, portanto, essencial para a transcrição no geral. O complexo Mediador é composto por proteínas que estão associadas em quatro grupos: a cabeça, o meio, a cauda e o complexo Cdk8 cinase. As proteínas da cabeça e do meio, são centrais para o recrutamento do complexo Mediador para os promotores, e deletar genes destes grupos torna-se letal para a célula. Já as proteínas da cauda e do complexo Cdk8 cinase, têm uma função mais regulatória na transcrição, e a sua deleção não compromete a viabilidade celular. Confirmou-se com recurso a uma proteína de fusão Gfp_Pgd1, que o Pgd1 está localizado de forma constitutiva no núcleo de células de C. glabrata, independentemente de estas terem sido expostas ou não a azóis. Para além disso, ao expressar o PGD1 a partir de um plasmídeo, verificou-se que há a complementação dos fenótipos exibidos pelo mutante Δpgd1, e que a sobre-expressão do PGD1 leva a aumento da suscetibilidade de C. glabrata a azóis em meio líquido. De modo a compreender o papel do Pgd1 na regulação global da transcrição, imposta pela exposição a azóis, uma estirpe selvagem (“wild type”) e um mutante de eliminação Δpgd1 foram crescidos em meio sólido ou líquido, na presença de uma concentração inibitória de fluconazol. Através da técnica de sequenciação de RNA, descobriu-se que a deleção do PGD1, na presença de fluconazol, afeta a expressão de 972 genes. Estes genes foram classificados manualmente quanto à sua função e relação com mecanismos de resistência a azóis, ou alterações na sua expressão em estirpes resistentes a azóis, recorrendo também a ferramentas computacionais como “GoToolBox” e o “Pathoyeastract”. Identificou-se que o Pgd1 controla a expressão de genes com várias funções diferentes dentro da célula, desde metabolismo de carbohidratos, adesão, reparação de DNA ou mesmo tráfico intracelular, incluindo até vários genes cuja função ainda é desconhecida em C. glabrata. Mas o mais relevante é que o Pgd1 controla genes relacionados com a biossíntese de ergosterol e metabolismo de lípidos, e também está envolvido na transcrição de genes envolvidos na resposta a drogas. De facto, o Pgd1, na presença de azóis, regula a transcrição de genes envolvidos nas vias afetadas por estes antifúngicos, biossíntese de ergosterol e metabolismo de lípidos, e de genes que podem ter alguma função na resposta a drogas, que confiram resistência ou pelo menos tolerância a antifúngicos Dado o efeito dual do Pgd1 em meio sólido e meio líquido, 36 genes foram selecionados para estudos adicionais, devido a terem regulação dual da sua expressão, consoante o meio ser líquido ou sólido. Nove desses genes são simultaneamente ativados pelo Pgd1 em meio sólido, e reprimidos em meio líquido, e os outros 27 são simultaneamente reprimidos pelo Pgd1 em meio sólido e ativados em meio líquido. No entanto só se conseguiu avaliar o efeito da deleção de 23 desses genes. Isto foi feito através de ensaios de suscetibilidade a drogas, nomeadamente através de ensaios de “spots”, em meio sólido, e de concentração mínima inibitória (CMI), em meio líquido, ambos para três antifúngicos da classe dos azóis: fluconazol, cetoconazol e posaconazol. Entre estes genes, apenas se confirmou o gene CDR1 como um determinante claro de resistência a azóis, o que é consistente com o seu papel como bomba de efluxo de azóis, sobre-expresso em estirpes resistentes a azóis, normalmente por causa de mutações de ganho de função no fator de transcrição Pdr1. Pelo que foi observado neste estudo, é possível que o impacto que o Pgd1 tem na expressão de CDR1 explique por si só o fenótipo dual observado no mutante Δpgd1. A expressão de CDR1 é maioritariamente controlada pelo fator de transcrição Pdr1, muito ligado a resistência aos azóis. Este fator de transcrição, após interação física com azóis, recruta a subunidade da cauda do complexo Mediador Gal11. Sabe-se também que ao eliminar por completo a proteína Pgd1, a capacidade de Gal11 se ligar ao resto do complexo, e de interagir com fatores de transcrição como Pdr1, fica afetada. Assim, o modelo que se propõe neste trabalho é que o Pgd1 seja necessário para a interação entre Pdr1-Gal11 e o resto das subunidades do complexo Mediador, controlando assim, através do Pdr1, a expressão do gene CDR1. Ainda assim continuamos com várias questões por explicar, nomeadamente em relação à atividade do Pgd1 como determinante de suscetibilidade a azóis em meio líquido. No futuro seria interessante estudar a interação do Pgd1 com as outras subunidades do complexo Mediador, ou até interações entre o Pgd1 e outros fatores de transcrição associados à resistência a azóis, tal como o Pdr1 e outros. Seria também interessante avaliar como as diferentes condições do meio ambiente afetam as interações que são estabelecidas entre fatores de transcrição e componentes da maquinaria transcricional. Seria também muito relevante avaliar a importância clínica dos dados obtidos neste estudo, incluindo a avaliação do eventual papel de mutações no PGD1 em isolados clínicos resistentes em comparação com isolados clínicos suscetíveis de C. glabrata.

2021Dissertação de mestrado

Acesso aberto

Ver mais

Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Programa de financiamento

3599-PPCDT

Número da atribuição

PTDC/BII-BIO/28216/2017