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- ISBE Newsletter nº 76: A administração combinada de remdesivir e baricitinib em doentes internados com Covid-19 parece ser mais eficaz do que administrar remdesivir isoladamente, nomeadamente nos quadros mais graves - A vacina contra a gripe (influenza) parece proteger os doentes internados com Covid-19 gravePublication . Carneiro, António Vaz; Neto, SusanaO objectivo da Newsletter do Instituto de Saúde Baseado na Evidência (ISBE) é a disponibilização de informação sobre áreas relevantes para a prática clínica, baseada na melhor evidência científica. São localizados estudos relevantes e de alta qualidade, criticamente avaliados pela sua validade, importância dos resultados e aplicabilidade prática e resumidos numa óptica de suporte à decisão clínica. É dada prioridade aos estudos de causalidade – revisões sistemáticas, ensaios clínicos, estudos de coorte prospectivos/retrospectivos, estudos seccionais cruzados e caso‐controlo – incluindo‐se ainda, quando justificado, estudos qualitativos considerados de elevada qualidade metodológica e importância clínica.
- Spiro-ß-lactam BSS-730A Displays Potent Activity against HIV and PlasmodiumPublication . Bártolo, Inês; Santos, Bruna S.; Fontinha, Diana; Machado, Marta; Francisco, Denise; Sepodes, Bruno; Rocha, Joao; Mota-Filipe, Hélder; Pinto, Rui; Figueira, Maria-Eduardo; Barroso, Helena; Nascimento, Teresa; Matos, António P. Alves de; Alves, Américo; Alves, Nuno G.; Simões, Carlos J. V.; Prudêncio, Miguel; Melo, Teresa M. V. D. Pinho E; Taveira, NunoThe high burden of malaria and HIV/AIDS prevents economic and social progress in developing countries. A continuing need exists for development of novel drugs and treatment regimens for both diseases in order to address the tolerability and long-term safety concerns associated with current treatment options and the emergence of drug resistance. We describe new spiro-β-lactam derivatives with potent (nM) activity against HIV and Plasmodium and no activity against bacteria and yeast. The best performing molecule of the series, BSS-730A, inhibited both HIV-1 and HIV-2 replication with an IC50 of 13 ± 9.59 nM and P. berghei hepatic infection with an IC50 of 0.55 ± 0.14 μM with a clear impact on parasite development. BSS-730A was also active against the erythrocytic stages of P. falciparum, with an estimated IC50 of 0.43 ± 0.04 μM. Time-of-addition studies showed that BSS-730A potentially affects all stages of the HIV replicative cycle, suggesting a complex mechanism of action. BSS-730A was active against multidrug-resistant HIV isolates, with a median 2.4-fold higher IC50 relative to control isolates. BSS-730A was equally active against R5 and X4 HIV isolates and displayed strong synergism with the entry inhibitor AMD3100. BSS-730A is a promising candidate for development as a potential therapeutic and/or prophylactic agent against HIV and Plasmodium.
- Progression of behavioral disturbances and neuropsychiatric symptoms in patients with genetic frontotemporal dementiaPublication . Benussi, Alberto; Premi, Enrico; Gazzina, Stefano; Brattini, Chiara; Bonomi, Elisa; Alberici, Antonella; Jiskoot, Lize; van Swieten, John C; Sanchez-Valle, Raquel; Moreno, Fermin; Laforce, Robert; Graff, Caroline; Synofzik, Matthis; Galimberti, Daniela; Masellis, Mario; Tartaglia, Carmela; Rowe, James B; Finger, Elizabeth; Vandenberghe, Rik; De Mendonça, Alexandre; Tagliavini, Fabrizio; Santana, Isabel; Ducharme, Simon; Butler, Chris R; Gerhard, Alexander; Levin, Johannes; Danek, Adrian; Otto, Markus; Frisoni, Giovanni; Ghidoni, Roberta; Sorbi, Sandro; Le Ber, Isabelle; Pasquier, Florence; Peakman, Georgia; Todd, Emily; Bocchetta, Martina; Rohrer, Jonathan D; Borroni, BarbaraImportance: Behavioral disturbances are core features of frontotemporal dementia (FTD); however, symptom progression across the course of disease is not well characterized in genetic FTD. Objective: To investigate behavioral symptom frequency and severity and their evolution and progression in different forms of genetic FTD. Design, setting, and participants: This longitudinal cohort study, the international Genetic FTD Initiative (GENFI), was conducted from January 30, 2012, to May 31, 2019, at 23 multicenter specialist tertiary FTD research clinics in the United Kingdom, the Netherlands, Belgium, France, Spain, Portugal, Italy, Germany, Sweden, Finland, and Canada. Participants included a consecutive sample of 232 symptomatic FTD gene variation carriers comprising 115 with variations in C9orf72, 78 in GRN, and 39 in MAPT. A total of 101 carriers had at least 1 follow-up evaluation (for a total of 400 assessments). Gene variations were included only if considered pathogenetic. Main outcomes and measures: Behavioral and neuropsychiatric symptoms were assessed across disease duration and evaluated from symptom onset. Hierarchical generalized linear mixed models were used to model behavioral and neuropsychiatric measures as a function of disease duration and variation. Results: Of 232 patients with FTD, 115 (49.6%) had a C9orf72 expansion (median [interquartile range (IQR)] age at evaluation, 64.3 [57.5-69.7] years; 72 men [62.6%]; 115 White patients [100%]), 78 (33.6%) had a GRN variant (median [IQR] age, 63.4 [58.3-68.8] years; 40 women [51.3%]; 77 White patients [98.7%]), and 39 (16.8%) had a MAPT variant (median [IQR] age, 56.3 [49.9-62.4] years; 25 men [64.1%]; 37 White patients [94.9%]). All core behavioral symptoms, including disinhibition, apathy, loss of empathy, perseverative behavior, and hyperorality, were highly expressed in all gene variant carriers (>50% patients), with apathy being one of the most common and severe symptoms throughout the disease course (51.7%-100% of patients). Patients with MAPT variants showed the highest frequency and severity of most behavioral symptoms, particularly disinhibition (79.3%-100% of patients) and compulsive behavior (64.3%-100% of patients), compared with C9orf72 carriers (51.7%-95.8% of patients with disinhibition and 34.5%-75.0% with compulsive behavior) and GRN carriers (38.2%-100% with disinhibition and 20.6%-100% with compulsive behavior). Alongside behavioral symptoms, neuropsychiatric symptoms were very frequently reported in patients with genetic FTD: anxiety and depression were most common in GRN carriers (23.8%-100% of patients) and MAPT carriers (26.1%-77.8% of patients); hallucinations, particularly auditory and visual, were most common in C9orf72 carriers (10.3%-54.5% of patients). Most behavioral and neuropsychiatric symptoms increased in the early-intermediate phases and plateaued in the late stages of disease, except for depression, which steadily declined in C9orf72 carriers, and depression and anxiety, which surged only in the late stages in GRN carriers. Conclusions and relevance: This cohort study suggests that behavioral and neuropsychiatric disturbances differ between the common FTD gene variants and have different trajectories throughout the course of disease. These findings have crucial implications for counseling patients and caregivers and for the design of disease-modifying treatment trials in genetic FTD.
- Role of the N-glycolylation of mycobacterial peptidoglycan in host immune recognition and antibiotic resistancePublication . Silveiro, Cátia Raquel Lopes; Catalão, Maria JoãoNos últimos anos, a tuberculose (TB) tornou-se uma emergência de saúde global, principalmente devido ao surgimento de estirpes multirresistentes e extensivamente resistentes do seu agente etiológico, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Este problema é acentuado pela relativa ineficácia da vacina BCG e dos agentes antimicobacterianos atualmente conhecidos e, pela falta de alternativas terapêuticas para a TB. Com quase dois milhões de mortes por TB anualmente, é urgente encontrar uma vacina eficaz contra a doença, desenvolver ferramentas de diagnóstico rápido e criar melhores esquemas de tratamento. Assim, é fundamental um melhor esclarecimento do mecanismo da patogénese da TB, que é atualmente mal compreendido, devido à estrutura altamente complexa da parede celular micobacteriana. A camada de peptidoglicano (PG) da parede celular micobacteriana é particularmente relevante, uma vez que apresenta modificações únicas, das quais a N-glicolilação do ácido murâmico, catalisada pela atividade da hidroxilase do ácido N-acetil murâmico (NamH), é de especial interesse. Estudos anteriores demonstraram que a N-glicolilação do PG promove a resistência a antibióticos β-lactâmicos e à lisozima. Da mesma forma, outros estudos demonstraram que a N-glicolilação do PG parece estimular a imunogenicidade da parede celular micobacteriana. Apesar de não ser um gene essencial, o namH é altamente conservado em estirpes clínicas de Mtb, o que indica que a N-glicolilação do PG possui uma função importante na resistência a antibióticos e/ou na patogénese da TB. Assim, o objetivo principal desta tese foi modular a expressão do namH de modo a compreender a importância da N-glicolilação do PG micobacteriano na resistência aos antibióticos e no reconhecimento das micobactérias por parte do hospedeiro. Para isso, vários mutantes knockdown do namH (namH-) foram construídos em M. smegmatis e M. tuberculosis H37Ra, usando uma nova e eficaz ferramenta molecular de regulação da transcrição, o CRISPR de interferência (CRISPRi). Esta técnica baseia-se na expressão induzida, com anidrotetraciclina (ATc), de um complexo dCas9-sgRNA para impedir a transcrição da sequência alvo, o que permite a investigação da função do gene de interesse, neste caso do namH. Os mutantes knockdown do namH construídos em M. smegmatis foram caracterizados através da realização de várias experiências: curvas de crescimento e plaqueamento de diluições seriadas de cada cultura numa área circular delimitada designada por spot. Estas experiências mostraram que quer a deleção quer a repressão do gene namH não origina defeitos graves no crescimento de M. smegmatis, confirmando-se assim que este gene não é essencial. Além disso, foi possível observar um nível residual de toxicidade da dCas9Sth1 durante as curvas de crescimento, ao verificar-se que o controlo M. smegmatis:PLJR962 cresce ligeiramente mais devagar na presença de indutor. Embora não tenha sido possível confirmar a repressão do namH em todos os mutantes knockdown, a repressão deste gene no mutante knockdown induzido M. smegmatis C2 ATc foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e confirmada. Além disso, constatou-se que o CRISPRi provoca polaridade, ou seja, uma diminuição significativa da transcrição do gene a jusante. No entanto, não foi possível investigar de que modo a força da PAM escolhida, a cadeia de DNA alvo e o local alvo afetam a eficiência do CRISPRi. De seguida, o papel da N-glicolilação do PG na suscetibilidade a vários antibióticos foi investigado através da realização de ensaios para determinar a concentração mínima inibitória (CMI) e a concentração mínima bactericida (CMB) de diversos β-lactâmicos (amoxicilina, cefotaxima, meropenem), na presença e ausência do inibidor de β-lactamase clavulanato, e de alguns agentes antimicobacterianos (etambutol e isoniazida) para todos os mutantes knockdown em M. smegmatis, na presença e ausência de indutor. Os resultados obtidos mostraram que o meropenem é mais eficiente ao inibir o crescimento das micobactérias do que a amoxicilina ou a cefotaxima. Este efeito parece ser causado pela resistência inerente do meropenem às β-lactamases micobacterianas e, também, devido a uma inibição simultânea de L,D-transpeptidases e, algumas D,D-transpeptidases e D,D-carboxipeptidases. Além disso, constatou-se que a N-glicolilação do PG tem um papel significativo na resistência aos β-lactâmicos, uma vez que tanto o mutante de deleção do namH (ΔnamH) quanto os mutantes knockdown induzidos exibiram um fenótipo de suscetibilidade à maioria dos β-lactâmicos. Da mesma forma, foi observada uma correlação relevante entre a N-glicolilação do PG e o mecanismo de ação da cefotaxima pois os mutantes namH- exibiram uma diminuição particularmente significativa da CMI da cefotaxima ou da cefotaxima-clavulanato na presença de indutor. Verificou-se ainda que a principal β-lactamase de M. smegmatis (BlaS) hidrolisa os antibióticos β-lactâmicos com diferente eficiência, pois a adição de clavulanato aos β-lactâmicos diminuiu consideravelmente a CMI da amoxicilina, o que não aconteceu no caso da cefotaxima e do meropenem. Os ensaios de CMB mostraram que todos os β-lactâmicos possuem atividade bactericida para a maioria das amostras de M. smegmatis testadas, o que indica que a N-glicolilação do PG não afeta consideravelmente a capacidade dos β-lactâmicos matarem as micobactérias. No entanto, verificou-se que a indução do sistema de CRISPRi pareceu aumentar a atividade bactericida dos β-lactâmicos em alguns casos, em que os mutantes knockdown do namH eram mais facilmente mortos na presença de indutor. Os ensaios de difusão em disco permitiram a determinação das zonas de inibição do meropenem para todos os mutantes knockdown construídos em M. smegmatis, com e sem indutor. Tal como tinha sido demonstrado anteriormente, os resultados destes testes sugeriram que a proteína NamH desempenha um papel na resistência ao meropenem, pois tanto o mutante de deleção do namH (ΔnamH) quanto os mutantes de knockdown do namH induzidos exibiram um fenótipo exacerbado de hipersuscetibilidade ao meropenem. Estas experiências demonstraram que os mutantes de deleção/repressão do namH são mais suscetíveis à maioria dos β-lactâmicos. Este “fenótipo de hipersuscetibilidade aos β-lactâmicos” pode, então, ser explicado pela inibição: i) da atividade hidrolítica de β-lactamase da NamH; ii) da atividade de monooxigenase/hidroxilase da NamH, que modifica os açúcares do PG micobacteriano; iii) ambas as atividades, permitindo uma sinergia entre a inibição da atividade de β-lactamase e a inibição da N-glicolilação do PG. De facto, a redução da atividade de hidroxilase da NamH tem como consequências: i) a diminuição da integridade do PG devido a uma menor disponibilidade de grupos N-glicolil para estabelecer ligações de hidrogénio; ii) a alteração da polimerização do PG devido a uma menor disponibilidade de precursores do PG que estejam N-glicolilados. Assim, a deleção/repressão do namH pode ser utilizada em sinergia com o tratamento com β-lactâmicos para diminuir a integridade do PG micobacteriano. A contribuição da N-glicolilação do PG para o reconhecimento pelo sistema imunitário do hospedeiro foi avaliada através da realização de infeções de macrófagos de ratinho RAW 264.7 com um mutante namH- selecionado, M. smegmatis C2. Verificou-se que os macrófagos são mais eficazes a erradicar o mutante de knockdown induzido C2 ATc do que qualquer outra bactéria no t=24h, o que sugere que a presença do PG N-glicolilado promove a sobrevivência intracelular, possivelmente ao aumentar o fitness das micobactérias dentro dos macrófagos. Esta observação parece indicar que a N-glicolilação do PG provoca um menor reconhecimento das micobactérias por parte dos macrófagos, o que não é unânime visto que grande parte dos estudos anteriores verificou que a N-glicolilação do PG potencia o reconhecimento imunológico e a subsequente resposta imune. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese ajudou a esclarecer o papel da N-glicolilação do PG na suscetibilidade aos antibióticos, ao levantar novas hipóteses sobre a forma como a proteína NamH promove a resistência aos β-lactâmicos. Do mesmo modo, esta tese também levantou questões importantes sobre o papel da N-glicolilação do PG nas interações patogénio-hospedeiro, nomeadamente ao nível do reconhecimento imune. Os resultados apresentados e as conclusões alcançadas poderão ser relevantes para uma melhor compreensão da patogénese da TB e para o desenvolvimento de terapêuticas alternativas para o tratamento da TB, no futuro.