Browsing by Author "Pereira, Ricardo Barradas"
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- Assessment of neurometabolic dysfunction and editing mitochondrial genome in the context of leigh syndrome by using induced pluripotent stem cell modelsPublication . Pereira, Ricardo Barradas; Prigione, Alessandro; Cruz, Susana Zeferino Solá daA Síndrome de Leigh (LS) é uma doença mitocondrial rara e complexa que inicia normalmente durante a infância. É causada por danos na produção de energia devido a mutações no ADN nuclear e/ou mitocondrial. Os doentes com LS apresentam uma vasta gama de sintomas, tais como hipotonia e atraso no desenvolvimento neurológico. A LS tem sido associada ao metabolismo lipídico desde que foi demonstrado que níveis mais elevados de certos ácidos gordos no plasma aumentam o risco de desenvolvimento da doença. Este trabalho teve como objetivos: 1) validar um modelo de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) com base na edição do genoma nuclear para estudar a LS; 2) investigar possíveis alterações nestas células por exposição a diferentes tipos de lípidos; e 3) gerar um novo modelo da LS através da edição do genoma mitocondrial. Para os dois primeiros objetivos, foram geradas células progenitoras neurais (NPCs) humanas com uma mutação nuclear específica da LS a partir de iPSCs humanas, assim como NPCs isogénicas de controlo. Ensaios de imunocitoquímica e qPCR ajudaram-nos a confirmar a eficácia da geração de NPCs. Curiosamente, a análise de Western blot indicou várias alterações em proteínas relacionadas com o metabolismo mitocondrial em NPCs com uma mutação nuclear específica da LS (nLS-like NPCs) quando comparados com NPCs de controlo, apoiando a validação deste modelo para estudar a disfunção mitocondrial em LS. Além disso, a análise metabólica do secretoma derivado de nLS-like NPCs revelou diferenças em vários metabolitos importantes, com destaque para o lactato e o piruvato. Surpreendentemente, ambos estão diminuídos em nLS-like NPCs, estando talvez relacionados com um aumento da glicólise e consumo de piruvato no interior das células. Relativamente ao segundo objetivo, descobrimos que concentrações crescentes de um ácido gordo de cadeia longa (LCFA), ácido oleico, e dois ácidos gordos de cadeia curta (SCFAs), propionato de sódio e butirato de sódio, podem aumentar a viabilidade tanto das NPCs de murganho como de humanos. Contudo, doses mais elevadas de SCFAs promoveram o efeito inverso em nLS-like NPCs, indicando que as NPCs dos doentes com LS poderão ser mais sensíveis a elevados níveis destes tipos de lípidos de cadeia curta saturados. Em relação ao último objetivo, em primeiro lugar foi realizada a identificação dos locais-alvo no ADN mitocondrial (mtDNA) associados a LS. Depois procedemos à sua confirmação, através da extração do mtDNA de células renais embrionárias humanas (HEKCs) e iPSCs, as primeiras para otimização e as últimas como a linha de células-alvo adequada. De seguida, procedemos à amplificação dos locais-alvo através de PCR e, seguidamente, por Sanger sequencing. Entretanto, utilizando a ferramenta de edição do genoma mitocondrial mediada por DdCBE (CRISPR/Cas), foi possível realizar a clonagem por Golden Gate cloning, o que tornou possível a inserção das mutações pretendidas. No conjunto, os resultados mostraram que as iPSCs poderão ser muito promissoras para o estudo da patogénese e possíveis terapias da LS. Além disso, os resultados revelaram não apenas que lípidos saturados de cadeia curta parecem impactar de forma negativa as NPCs dos doentes com LS, mas também que a edição do genoma mitocondrial em iPSCs parece ser um método exequível para gerar modelos celulares da LS associados a mutações mitocondriais.